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Jun 12, 2023

Un estudio comparativo revela la importancia relativa de las rodopsinas de la bomba de protones procarióticas y eucariotas en un mar marginal subtropical

ISME Communications volumen 3, Número de artículo: 79 (2023) Cite este artículo 262 Accesos 4 Detalles de Altmetric Metrics La rodopsina de la bomba de protones (PPR) en microbios marinos puede convertir la energía solar en

Comunicaciones ISME volumen 3, Número de artículo: 79 (2023) Citar este artículo

262 Accesos

4 altmétrico

Detalles de métricas

La rodopsina con bomba de protones (PPR) en microbios marinos puede convertir la energía solar en energía química biodisponible. Mientras que la PPR bacteriana se ha estudiado ampliamente, sus contrapartes en microeucariotas están menos exploradas y la importancia relativa de los dos grupos no se comprende bien. Aquí, secuenciamos metatranscriptomas de ensamblaje completo e investigamos la diversidad y la dinámica de expresión de PPR en eucariotas y procariotas microbianos en una plataforma continental y un talud en el norte del Mar de China Meridional. Los datos mostraron que todo el conjunto de transcripciones de PPR estaba dominado por proteorhodopsinas y xantodopsinas, seguidas por proteínas similares a bacteriorrodopsinas, aportadas predominantemente por procariotas tanto en el número como en los niveles de expresión de PPR unigenes, aunque en la estación del talud continental, los microeucariotas y procariotas contribuyeron de manera similar en la transcripción. abundancia. Además, los PPR eucariotas son aportados principalmente por dinoflagelados y mostraron una correlación significativa con las concentraciones de nutrientes. Las PPR que absorben luz verde se distribuyeron principalmente en organismos >3 μm (incluidos los microeucariotas y sus bacterias asociadas), especialmente en la capa superficial de la estación de plataforma, mientras que las PPR que absorben luz azul dominaron las comunidades <3 μm (principalmente bacterianas) en ambos estudios. sitios, especialmente en capas más profundas en la estación del talud. Nuestro estudio retrata un genotipo comparativo de PPR y un panorama de expresión para procariotas y eucariotas en un mar marginal subtropical, lo que sugiere el papel de PPR en la diferenciación de nichos y la adaptación entre microbios marinos.

Actualmente se conocen rodopsinas en los tres dominios de la vida. La más conocida es la rodopsina sensorial para la visión en ojos de animales. Las rodopsinas funcionalmente más diversas se encuentran en organismos microbianos (rodopsinas microbianas) [1]. Los descubrimientos iniciales de rodopsinas microbianas se remontan a la década de 1970, cuando las rodopsinas de Halobacterium halobium se caracterizaron como bombas de protones o cloruro [2,3,4]. Después de un período de inactividad de dos décadas, el interés por las rodopsinas microbianas se reavivó con el descubrimiento de las rodopsinas con bomba de protones (PPR), una subfamilia de rodopsinas microbianas, en el clado SAR86 [5] y muchas otras bacterias en la superficie del océano. Los PPR bombean protones desde el citoplasma hacia el exterior celular y crean un gradiente de protones que tiene la fuerza para impulsar la producción de ATP [6]. Se informó ampliamente que estas rodopsinas que capturan fotoenergía se encuentran en el 48% de las partículas de tamaño pequeño (<0,8 μm) en la zona fótica del océano [7, 8] o en el 13-70% de las bacterias que viven en la superficie del océano [9, 10]. . Ahora se sabe que se distribuyen abundantemente a nivel mundial, desde el sistema acuático (incluidos los sistemas marinos y de agua dulce) hasta los sistemas edáficos [11], desde el trópico [12] hasta las regiones polares [13, 14] y, taxonómicamente, desde las regiones gigantes. virus y organismos eubacterianos [2, 14,15,16] hasta microbios eucariotas [17, 18].

La mayoría de las rodopsinas microbianas con bomba de protones documentadas hasta ahora son bombas de protones hacia afuera, que funcionan para producir ATP en las células, aunque también se han informado rodopsinas con bomba de protones hacia adentro (es decir, xenorrodopsinas y esquizorrodopsinas) [19,20,21]. Por esa razón y para ser breve, el término PPR se utilizará de ahora en adelante para representar las rodopsinas microbianas que se descubrió que eran rodopsinas de bomba de protones hacia afuera, el enfoque del presente estudio. Las PPR encontradas hasta el momento incluyen proteorodopsinas (PR) [22,23,24], bacteriorrodopsinas (BR) [25], xantorhodopsinas (XR) [26, 27], exiguobacterium rodopsinas (ESR) [28] y actinorrodopsinas (ActR) [29 ]. Como se mencionó anteriormente, los PPR pueden hiperpolarizar el potencial de membrana, lo que podría sintetizar ATP en beneficio de los microorganismos que contienen PPR [30]. Sin embargo, el papel ecológico de las diversas PPR no está completamente claro, aunque los estudios han demostrado en general que promueven el crecimiento o la supervivencia de sus microbios portadores en ambientes pobres en nutrientes [24, 31]. En los dinoflagelados, los PPR pueden proporcionar energía para apoyar el crecimiento en condiciones de escasez de alimentos o de nutrientes o de luz [32, 33]. En las diatomeas, los PPR han sido implicados en hacer frente a la limitación de hierro [18].

La importancia relativa de las PPR procarióticas y eucariotas en el océano no se comprende bien, tanto en términos de la contribución de cada grupo a la diversidad total como de la expresión total (actividad potencial) de las PPR. Sólo un número limitado de estudios ha documentado PPR expresados ​​en microeucariotas en el entorno marino natural, que se centraron principalmente en dinoflagelados [17], diatomeas [18] y otros eucariotas microbianos [13]. Gracias a la creciente accesibilidad de la secuenciación de alto rendimiento, los estudios metatranscriptómicos sobre floraciones de dinoflagelados han revelado altas diversidades y alta expresión de PPR en la especie de floración Prorocentrum shikokuense (anteriormente Prorocentrum donghaiense), lo que sugiere que las PPR podrían funcionar para alimentar las floraciones en condiciones de poca luz o fósforo. ambientes limitados en nutrientes [34, 35]. Sin embargo, la distribución diferencial de la PPR entre eucariotas y procariotas y los niveles de expresión relativos de las PPR procarióticas y eucariotas aún no se han explorado lo suficiente. Un estudio reciente midió la concentración retiniana como indicador de la abundancia de PPR en un transecto del océano Mediterráneo-Atlántico y encontró que las PPR microbianas allí eran aportadas principalmente por bacterias; estimaron que las PPR procarióticas podrían absorber tanta energía luminosa como la fototrofia basada en clorofila a, suficiente para mantener el metabolismo basal bacteriano en los mares oligotróficos [36].

Además, se sabe que las mutaciones puntuales alteran los máximos de absorción en las PPR. Por lo tanto, algunas PPR (es decir, proteorodopsinas, PR) absorben luz verde (GPR, λmax = 525 nm) y otras absorben luz azul (BPR, λmax = 490 nm) [37, 38]. La sintonización espectral de los PPR de luz azul a verde se debe a la sustitución de un residuo de aminoácido en la bolsa de la retina. En la posición 105 del PPR típico, es una metionina o leucina en GPR pero es la glutamina polar en BPR [24, 39, 40]. Un nuevo estudio encontró que en los dos RP denominados ISR34 e ISR36, además de la posición 105, Cys189 es un residuo vital que controla la sintonización espectral [41]. No se comprende bien cómo se distribuyen espacial y taxonómicamente estos dos tipos de PPR en el océano.

Este estudio aborda las lagunas de investigación mencionadas anteriormente mediante el uso de secuenciación de metatranscriptomas. Los datos se utilizaron para analizar la diversidad y los niveles de expresión relativos de las PPR, tanto en procariotas como en eucariotas, en el norte del Mar de China Meridional (NSCS), un mar marginal subtropical.

Se recolectaron muestras de agua de mar en dos sitios, la estación de la plataforma continental (C6, 117,46°E, 22,13°N) y la estación del talud continental (C9, 117,99°E, 21,69°N) (Fig. S1), del Estrecho de Taiwán a bordo del Buque de investigación Yanping II del 6 al 12 de agosto de 2016. Se recolectaron muestras en la superficie (SUR), la capa profunda de máximo de clorofila (DCM) y el fondo de la zona fótica (BOT) utilizando Seabird CTD (perfilador de conductividad, temperatura y profundidad). Rosetón equipado con botellas Niskin de 12 litros. Para cada muestra, se prefiltraron de 20 a 60 litros (detalles en el Suplemento 2) de agua de mar a través de 200 μm para eliminar organismos grandes y luego se filtraron en serie sobre una membrana de policarbonato de 3 μm y 0,22 μm de tamaño de poro y 142 mm de diámetro ( Merck Millipore, MA, EE.UU.). Los filtros se transfirieron inmediatamente a un tubo de 2 ml (KIRGEN, Shanghai, China) sumergido con tampón regente TRIzol y se almacenaron en nitrógeno líquido durante el crucero y luego se almacenaron a -80 °C en el laboratorio hasta la extracción del ARN. Se recolectaron dos muestras replicadas de cada evento de muestreo. En total, se recogieron 20 muestras para el análisis del transcriptoma. Se recolectaron veinte muestras para el análisis de los genes 16 S y 18 S rRNA (rDNA SSU) de la misma manera que las muestras de ARN, pero se sumergieron en un tampón de lisis de ADN antes de almacenarlas a -80 °C. El análisis de las muestras de ADN para caracterizar las estructuras de la comunidad microbiana se ha informado en otro lugar [42, 43].

Las bacterias de la fracción pequeña (0,22 a 3 μm) se consideran de vida libre, mientras que las de la fracción grande (3 a 200 μm) se consideran asociadas a partículas. Aunque no pudimos descartar la posibilidad de que algunas bacterias de vida libre pudieran quedar retenidas en la fracción grande cuando la membrana se obstruyó por la biomasa acumulada, creemos que es poco probable que estas bacterias "accidentales" dominen sobre las bacterias auténticas asociadas a partículas. , particularmente porque la biomasa en las estaciones oceánicas era generalmente baja. La temperatura, la salinidad y la turbidez se midieron utilizando CTD (SBE 17plus V2, Sea-Bird Scientific, Bellevue, WA, EE. UU.) en cada evento de muestreo. Las concentraciones de nitrógeno inorgánico disuelto (DIN) (nitrato y nitrito), silicato y fosfato se midieron utilizando un autoanalizador Technicon AA3 (Bran-Lube, Norderstedt, Alemania), y todas las mediciones se realizaron en muestras por triplicado.

El ARN se extrajo de las muestras de campo siguiendo nuestro protocolo informado anteriormente [34] que combina el procedimiento TRIzol con la columna de purificación de ARN Zymo e incorpora un molino de perlas FastPrep-24 (MP Biomedicals, Solon, EE. UU.) con 0,5 mm y 0,1 mm de diámetro. perlas de circonio/sílice (Biospec, Shanghai, China) para romper completamente las células. La pureza y la cantidad de ARN se evaluaron utilizando NanoDrop 2000 (Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) y Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE. UU.). Las muestras de ARN con un número de integridad de ARN (RIN) ≥ 6,0 se utilizaron para la secuenciación de RNA-seq (BGI, Shanghai, China). El ARN ribosómico de cada muestra (1 μg de ARN) se eliminó utilizando un kit de eliminación de ARNr Ribo-Zero™ (humano/ratón/rata), un kit de eliminación de ARNr Ribo-Zero™ (hoja de planta) y un kit de eliminación de ARNr Ribo-Zero™ (bacterias). ) (Illumina, San Diego, California, EE. UU.). El uso de la eliminación de ARNr en lugar del enriquecimiento de ARNm basado en oligo(dT) produjo ARNm tanto de procariotas como de eucariotas. Luego, el ARNm purificado se fragmentó con Elute, Prime, Fragment Mix. El ADNc de la primera cadena se sintetizó utilizando First Strand Master Mix y Super Script II Reverse Transcriptase (Invitrogen, CA, EE. UU.). Después de purificar el producto (Agencourt RNA Clean XP Beads, AGENCOURT; Beckman Coulter Genomics, Danvers, MA, EE. UU.), se sintetizó el ADNc de la segunda hebra agregando Second Strand Master Mix y una mezcla de dATP, dGTP, dCTP, dUTP. El ADNc de doble hebra se procesó mediante purificación, reparación de extremos y ligadura de adaptadores. Los fragmentos, que tenían aproximadamente 400 pb (tamaño de inserción de aproximadamente 250 pb), se seleccionaron y secuenciaron en el instrumento Illumina HiSeq 4000 (Illumina, San Diego, CA, EE. UU.). Finalmente, la secuenciación de alto rendimiento de Illumina de todas las muestras arrojó un total de lecturas sin procesar de 881 Gb.

Después de recortar los adaptadores de las lecturas sin procesar, se eliminaron secuencias con >5 % de bases ambiguas (N) y lecturas de baja calidad (>20 % de bases con un valor de calidad <20) para obtener lecturas limpias utilizando Soapnuke (versión 1.5.6). Se llevó a cabo un ensamblaje de novo para las lecturas limpias restantes usando Trinity, luego se usó Tgicl para agrupar transcripciones en unigenes con un mínimo de 95% de identidad entre los contigs [44]. Los conjuntos unigene de todas las muestras se fusionaron para generar el conjunto de datos unigene final (Unigene) para el análisis posterior. Las taxonómicas se analizaron utilizando BLASTX basado en NR y BLASTN basado en Nucleotide Squence Database (NT) (versión 20180814) con los siguientes valores de corte: valor E <10-5 e identidad>40%. Al mejor resultado con un fuerte valor e se le asignó el organismo a partir del cual se originó la secuencia microbiana de rodopsinas. La anotación funcional de SwissProt se realizó utilizando Diamond BLASTX [45]. Se usó Bowtie2 [46] para alinear lecturas limpias con el conjunto de datos unigene (como referencia), y luego se usó Salmon v0.9.1 [47] para calcular los niveles de expresión génica en cada muestra. En el análisis posterior, eliminamos los unigenes cuyo TPM (transcripciones por kilobase del modelo de exón por millón de lecturas mapeadas) fue inferior a 0,1 en las 20 muestras.

El análisis filogenético se realizó para evaluar la diversidad y clasificación de las rodopsinas (PPR y otros tipos de rodopsinas). Elegimos las secuencias de nuestros datos de metatranscriptoma que al menos contenían hélices transmembrana CF. Las secuencias de proteínas deducidas y las secuencias de referencia seleccionadas de la base de datos NCBI se alinearon utilizando el modelo muscular en MEGA X [48] (archivo complementario 3). Se utilizó la prueba modelo en MEGA X para encontrar el mejor modelo de evolución de aminoácidos. El árbol filogenético se infirió utilizando el método de máxima verosimilitud en MEGA X utilizando el modelo LG + G con 1000 réplicas de arranque realizadas para obtener soporte estadístico para la topología del árbol. Después de exportar el árbol en formato Newick, se agregó la modificación del color de los árboles filogenéticos utilizando iTOL.

Las muestras de fracciones de tamaño grande (3–200 µm) y pequeñas (0,2–3 µm) procedían de las mismas muestras de agua, aunque se secuenciaron por separado. Para facilitar la comparación de las contribuciones de procarióticos y eucariotas al conjunto de ARNm de rodopsina en cada muestra de agua, los datos de las dos fracciones de tamaño se combinaron después de ajustarlos para el volumen de la muestra de agua. Multiplicamos los TPM de rodopsinas procarióticas (Pro-TPM) o eucariotas (Euk-TPM) en las fracciones de tamaño pequeño y grande con sus respectivas cantidades de ARN extraído de las muestras de fracción de tamaño, respectivamente, agregamos los dos productos y luego dividimos el suma por la masa total de ARN extraída de ambas fracciones de tamaño del mismo volumen de muestra de agua, es decir, contribuciones de rodopsina de microbios procarióticos = (Pro-TPMsmall * RNAsmall por L+ Pro-TPMlarge * RNAlarge por L)/(RNAsmall por L + RNAlarge por L) y las contribuciones de rodopsina de los microbios eucariotas = (Euk-TPMsmall * RNAsmall por L + Euk-TPMlarge * RNAlarge por L)/(RNAsmall por L + RNAlarge por L). Estos permiten estimar la contribución de los microbios procarióticos (Pro) o eucarióticos (Euk) de ambas fracciones de tamaño al conjunto total de transcritos de rodopsina de cada comunidad de plancton (muestra de agua).

Calculamos distancias por pares entre muestras basadas en la matriz de abundancia de rodopsina microbiana o PPR (TPM), de microbios procarióticos o eucariotas, y la matriz de factores ambientales. Se eligieron los siguientes factores ambientales para el análisis de correlación: NO2- (μmol/L), PO43- (μmol/L), NO3-_NO2- (nitrato más nitrito, μmol/L), SiO32- (μmol/L), profundidad, temperatura, salinidad y relación N:P. Estas matrices de distancia se calcularon utilizando correlaciones parciales de Mantel en R Studio a través del paquete de software vegano R.

Para evaluar la significancia estadística de las diferencias observadas entre diferentes sitios de muestreo, fracciones de tamaño o profundidades de agua, se realizó el análisis de varianza (ANOVA) utilizando el paquete estadístico IBM SPSS (versión: 18). Todos los datos presentados en este estudio son medias con desviación estándar calculada a partir de muestras duplicadas en cada condición. La correlación lineal entre la expresión de PPR y la abundancia de microbios fuente se basó en el coeficiente de correlación de Pearson.

Como se mencionó anteriormente, las estructuras de la comunidad microbiana basadas en SSU (ADNr) se han informado en otros lugares [42, 43] y hay datos disponibles (números de BioProject PRJNA782430 y número de acceso CNP0001483). La secuenciación de alto rendimiento de nuestras muestras de ARN arrojó 881 Gb de datos sin procesar, lo que resultó en 792,7 Gb de lecturas limpias en total después del procesamiento de calidad. Estas lecturas se ensamblaron en 4.499.414 unigenes con N50 de 372 pb y una longitud máxima de 71.092 pb. Después del ensamblaje, la combinación computacional y la agrupación de todas las secuencias de ADNc de rodopsina de nuestros metatranscriptomas produjeron 1.765 unigenes de rodopsina.

Para clasificar estas secuencias en el esquema de clasificación de rodopsina existente, construimos un árbol filogenético utilizando secuencias de aminoácidos deducidas lo suficientemente largas como para incluir hélices CF (831 unigenes en total), con secuencias de referencia de NCBI para representar los grupos de rodopsina existentes. Los resultados del análisis filogenético mostraron que el grupo de proteorodopsinas (PR) contenía el mayor número de rodopsina unigenes, seguido de xantodopsinas (XR y GR en el árbol filogenético) y proteínas similares a bacteriorrodopsinas (incluyendo BR y SRI en el árbol filogenético) (Fig. 1). Casi todos estos son rodopsinas con bomba de protones hacia afuera impulsadas por luz (es decir, del tipo productor de ATP) o PPR para abreviar. En el árbol filogenético, también encontramos varios unigenes que estaban afiliados a la rodopsina-I sensorial, que es una rodopsina microbiana sin bomba de protones. Además, según los resultados de las anotaciones de SwissProt, en los metatranscriptomas existían otras rodopsinas sin bomba de protones, incluida la arqueerhodopsina de Halobacterium sp. y Halorubrum chaoviator, Cruxrhodopsin de Haloarcula argentinensis, rodopsina-II sensorial de Haloarcula vallismortis y Octopus rodopsina de Enteroctopus dofleini. Sin embargo, estos muchos tipos de clasificación de rodopsina exhibieron niveles de expresión bajos (Tabla 1).

Los diferentes colores muestran tipos de rodopsina, que están representados por secuencias de referencia marcadas en rojo. Los tipos de rodopsina se muestran en la parte medial izquierda. La escala del árbol se muestra en la parte superior izquierda. Bootstrap se muestra en la parte inferior izquierda. El número en los círculos representa el número total de rodopsina unigenes en el grupo. El número de acceso de Genbank de los PR, XR y GR de referencia es el siguiente: PR (AAG10475.1, AAK30179.1, BAN14807.1, AAZ21446.1), XR (AIN36550.1, ADY17811.1, ADY17809.1, ADY17808.1 , ABV22426.1, ABV22432.1, AAO14677.1, AEF32711.1, ABV22427.1, ADY17806.1, AJA37445.1, WP_011404249.1, AEP68177.1, AKG94905.1), GR (BAC88139.1).

El origen taxonómico de las rodopsinas microbianas detectadas en las muestras se determinó a partir de la anotación del metatranscriptoma en las bases de datos del NCBI. El resultado proporcionó una clara separación de rodopsinas procarióticas y eucariotas y asignó las secuencias a taxones específicos. En todos nuestros conjuntos de datos metatranscriptómicos combinados, los microbios procarióticos representaron el 71% del número de rodopsina unigenes y el 40-97% de la contribución de rodopsina, mientras que los microeucariotas (protistas) representaron el 27% del número de unigenes y el 2-60% de la contribución, respectivamente. Luego contamos todas las rodopsinas microbianas expresadas por microbios procarióticos y eucariotas tanto en la fracción pequeña (0,2–3 μm) como en la fracción grande (3–200 μm) y comparamos las diferencias según la estación y el linaje utilizando ANOVA no paramétrico. En los datos transcriptómicos de las muestras de la estación de plataforma (C6), la contribución de rodopsina en los microbios procarióticos fue más abundante que en los protistas (p <0,05, Fig. 2). Sin embargo, en las muestras de la estación de pendiente (C9), no hubo diferencias significativas entre procariotas y eucariotas en la contribución de rodopsina debido a grandes variaciones entre muestras (p > 0,05, Fig. 2). Además, entre los dos sitios de estudio, la contribución de rodopsinas microbianas totales en la estación de la plataforma continental pareció ser ligeramente mayor que en la estación del talud continental, pero sin significación estadística, independientemente de las fracciones de tamaño (Figs. 2 y 3).

Agua superficial SUR, máximo profundo de clorofila DCM, fondo BOT de la zona fótica.

En un diagrama de rosa Nightingale, diferentes colores indican rodopsinas de diferentes supergrupos de microbios. El radio de los sectores muestra el nivel de expresión en cada supergrupo de microbio. El ángulo central muestra la proporción de la transcripción de rodopsina de cada supergrupo microbiano en las transcripciones de rodopsina de todos los grupos microbianos. Agua superficial SUR, máximo profundo de clorofila DCM, fondo BOT de la zona fótica.

Para examinar la contribución de diferentes supergrupos de microbios a la expresión de rodopsina, se analizó el nivel de expresión (TPM) de las transcripciones de rodopsina en fracciones de diferentes tamaños en diferentes muestras. Según la anotación taxonómica en las bases de datos del NCBI, en las muestras de tamaño pequeño, las rodopsinas fueron expresadas principalmente por Proteobacteria, Bacteroidetes y Other_Bacteria, mientras que en las muestras de gran tamaño, las rodopsinas fueron expresadas predominantemente por Dinophyceae, Proteobacteria y Other_Bacteria (Fig. 3). . Las proteobacterias y Otras_Bacterias en la fracción de gran tamaño deberían estar asociadas, endosimbióticamente o ectosimbióticamente, con eucariotas, aunque algunas de ellas podrían ser bacterias de vida libre retenidas en los filtros debido a la obstrucción durante la filtración.

Según los resultados de la prueba de Mantel, la abundancia de transcripción de rodopsina microbiana total de protistas se correlacionó con la profundidad y la temperatura (Fig. 4A), mientras que la abundancia de transcripción de PPR de protistas se correlacionó con las concentraciones de nutrientes, incluido el fosfato (PO43-). nitrato más nitrito (NO3-_NO2-), y silicato (SiO32-), además de profundidad y temperatura (Fig. 4B). Por el contrario, la abundancia de transcripciones de rodopsina procariótica y rodopsina total (procariótica y eucariota combinadas) mostró una correlación débil con los parámetros ambientales.

A Las correlaciones entre la rodopsina microbiana y los factores ambientales. La Rodopsina-EUK, la Rodopsina-PRO y la Rodopsina-Total fueron las abundancias (TPM) de toda la rodopsina anotada en microbios eucariotas, procarióticos o conjunto de ARNm de rodopsinas microbianas totales, respectivamente. B Las correlaciones entre las PPR y los factores ambientales. PPR-EUK y PPR-PRO fueron la abundancia de PPR, incluidos PR, BR y XR de microbios procarióticos y eucariotas, respectivamente. PPR-Total es la abundancia (TPM) de todos los PPR de microbios procarióticos y eucariotas. El ancho del borde corresponde al estadístico r de Mantel para las correlaciones de distancia correspondientes. Los tamaños de las casillas y el número en las casillas indican el coeficiente de correlación de Pearson entre parámetros ambientales.

Los PPR que absorben la luz azul (BPR) contienen glutamina polar en el sitio de sintonización del espectro (105 del PPR típico), equivalente a la posición 104 en el PPR de P. shikokuense, mientras que los PPR que absorben la luz verde (GPR) contienen metionina o leucina. en esa posición [24, 39, 40]. Identificamos y contamos BPR y GPR de todos los unigenes en el grupo de rodopsina microbiana en función de los resultados de la anotación funcional en los conjuntos de datos de SwissProt. Tanto para las estaciones de plataforma como de pendiente, la expresión de BPR aumentó con el aumento de la profundidad, mientras que la expresión de GPR disminuyó con el aumento de la profundidad (Fig. 5). Los GPR se distribuyeron principalmente en microorganismos de gran tamaño de los conjuntos de superficie en la estación de plataforma. Por el contrario, las BPR fueron dominantes en los microorganismos de pequeño tamaño en ambos sitios de estudio, especialmente en las profundidades más profundas de la estación de la pendiente (Fig. 5).

Estación de estantería A, B; Estación de pendiente C, D. Los diferentes tonos de cuadros azules y verdes representan diferentes BPR y GPR expresados ​​por diferentes supergrupos de microbios. Los números en los cuadros indican la especie que expresa más (o las dos primeras) (que se muestra en la parte superior derecha) en su supergrupo (que se muestra en la parte inferior derecha). Las etiquetas a la izquierda de cada fila muestran la profundidad de muestreo: agua superficial SUR, máximo de clorofila profunda de DCM, fondo BOT de la zona fótica.

Según los resultados de las anotaciones de función y taxonomía, las PPR de procariotas que detectamos absorbieron predominantemente luz azul y fueron aportadas principalmente por Candidatus Pelagibacter ubique y algunas bacterias no cultivadas (Fig. 5). Candó. P. ubique es miembro de Pelagibacterales (SAR11). La abundancia de transcripción BPR de Pelagibacterales se correlacionó fuertemente con la abundancia relativa de Pelagibacterales (SAR11) según los datos del gen 16 S rRNA (Fig. 6A, R2 = 0,8338). Mientras tanto, las GPR también ocurrieron en procariotas, principalmente aportadas por Flavobacteriaceae (Fig. 5). De manera similar al caso de BPR en Pelagibacterales, la abundancia de transcripción de GPR en Flavobacteriaceae también mostró una fuerte correlación con la abundancia relativa de Flavobacteriaceae según los datos del gen 16 S rRNA (Fig. 6B, R2 = 0,801). Para los protistas, nuestros datos de metatranscriptoma mostraron que sus PPR eran predominantemente absorbentes de luz azul y fueron albergados y expresados ​​principalmente por las especies de dinoflagelados anotadas como Karlodinium micrum y Ceratium fusus, mientras que su rodopsina, que absorbe la luz verde, expresada principalmente por Alexandrium andersonii (Fig. 5), lo que indica que los dinoflagelados fueron los principales contribuyentes a las PPR de los protistas eucariotas en el área de estudio.

A Pelagibacterales, que está representado por SAR11; B Flavobacteriáceas. Los recuadros muestran la abundancia de los organismos en diferentes muestras.

Para explorar la relación entre los microbios y la expresión correspondiente de rodopsina, representamos un paisaje microbiano de rodopsina utilizando el método RNA-seq en lugar de la amplificación por PCR de rodopsina para evitar posibles sesgos de PCR. En las muestras de tamaño pequeño, el nivel de expresión de rodopsinas fue el más alto en Proteobacteria, mientras que en muestras de gran tamaño las rodopsinas fueron expresadas predominantemente por Dinophyceae (Fig. 3). Al mismo tiempo, según los resultados de la secuenciación de ADNr 16 S y 18 S, a nivel de filo/clase, Dinophyceae fue el más abundantemente representado entre los microbios eucariotas en nuestras muestras (Fig. S2A), mientras que las proteobacterias fueron el filo procariótico más abundante en Comunidades microbianas de los dos sitios de estudio (Fig. S2B). Sin embargo, debemos tener en cuenta que, como ocurre en cualquier estudio de metacódigo de barras basado en ADNr, la abundancia del código de barras (gen marcador) no representa directamente la abundancia de las células, porque el número de copias de ADNr por célula varía entre linajes y es particularmente alto en dinoflagelados [49]. Por lo tanto, las tendencias correspondientes de la expresión de PPR y la abundancia de ADNr para Proteobacterias y Dinophyceae sugieren la posibilidad de que PPR promueva el crecimiento de estos linajes, pero esto aún debe verificarse en el futuro utilizando datos de abundancia celular.

En total, en este estudio se detectaron siete tipos de rodopsina (PR, BR, XR, arqueerhodopsina, cruxrodopsina, rodopsina sensorial y rodopsina de pulpo), pero cada uno de ellos contribuyó al conjunto de ARNm de rodopsina en niveles muy diferentes. En el grupo de rodopsina microbiana, los PPR representaron del 16 al 98% del conjunto total de ARNm de rodopsina microbiana en diferentes muestras. Las PPR en nuestros sitios de estudio fueron principalmente PR y XR, seguidas de proteínas similares a BR (Fig. 1 y Tabla 1), todas las cuales se supone que son rodopsinas de bomba de protones hacia afuera impulsadas por luz que presumiblemente pueden impulsar la producción de ATP. Esta es la primera documentación del perfil de rodopsina en el NSCS y una de las pocas en el océano global que comparó la abundancia de rodopsina entre procariotas y eucariotas. Más recientemente, se descubrieron dos nuevos tipos de PPR, xenorrodopsinas y esquizorrodopsinas, que bombean protones hacia el interior [19,20,21], pero su distribución espacial y taxonómica es menos clara. Sin embargo, las rodopsinas de la bomba de protones hacia adentro no se encontraron en el grupo de ARNm en el presente estudio.

Entre los dos sitios de estudio, según los recuentos de lecturas relativas, hubo mayores abundancias de transcripciones de rodopsina en la región de la plataforma continental (C6) que en la región de la pendiente (C9) (Fig. 1 y Tabla 1). Además, en los datos transcriptómicos de las muestras de estante, la contribución del ARNm de PPR en los microbios procarióticos de las fracciones de tamaño pequeño y grande fue mayor que la de los microeucariotas (p <0,05, Fig. 2), lo que indica que los microbios procarióticos fueron contribuyentes más importantes de Mecanismo de conversión de energía solar basado en rodopsina que los protistas en la región de la plataforma continental. Sin embargo, en nuestros datos de transcripciones de muestras de ladera, no hubo diferencias significativas en la abundancia de ARNm de rodopsina entre los microbios procarióticos y los protistas, lo que indica que en la región del talud continental, el mecanismo de recolección de energía basado en PPR probablemente fue igualmente importante tanto para los procariotas como para los procariotas. protistas. Muchos de estos protistas son microalgas eucariotas (fitoplancton) (Figs. 3 y 5) y, por lo tanto, poseen no solo un sistema transductor de energía basado en rodopsina sino también un sistema de fotosíntesis basado en clorofila a, que tiene únicamente dos mecanismos de recolección de energía, o " motores duales”. La coexistencia de la rodopsina y el sistema de fotosíntesis podría ser importante para los protistas que habitan el entorno más pobre en nutrientes, que resultó estar en la estación de la plataforma continental que tomamos muestras en el NSCS, como lo indicaban nuestros datos de nutrientes (ver más abajo).

Estudios anteriores han demostrado que el mecanismo energético basado en PPR puede servir para mejorar las deficiencias de nutrientes como nitrógeno, fósforo o hierro [18, 33, 36, 50]. Para el fitoplancton marino, la limitación de nitrógeno deprime la fotosíntesis y el crecimiento, ya que se requiere nitrógeno para la síntesis de ácido nucleico, proteínas y Chl a; sin embargo, el precursor del retinal todo trans (equivalente funcional de Chl a) no se ve afectado por la limitación de nutrientes [51, 52]. Por lo tanto, los PPR podrían proporcionar energía suplementaria para permitir que la comunidad microbiana sobreviva en condiciones de limitación de nitrógeno.

En ambos sitios de estudio en el presente estudio, las concentraciones de nutrientes de nitrógeno y fósforo en la capa superficial fueron de 0,156 a 0,607 μmol/L y de 0,021 a 0,058 μmol/L respectivamente, con una relación N: P de <12,7 (archivo complementario 2), inferior a la proporción típica de Redfield de 16:1, lo que sugiere limitación de nitrógeno. Entre las dos estaciones, la concentración promedio de DIN y la relación N: P en la región de la plataforma fueron menores que en la región de la pendiente (archivo complementario 2) y, de acuerdo con las expectativas de estudios anteriores, se encontró una mayor abundancia de ARNm de PPR en microeucariotas en región de la plataforma. Esta relación PPR-nutriente se vio respaldada aún más por la correlación significativa encontrada entre la abundancia de transcripción de PPR microeucariotas y las concentraciones de nutrientes y la falta de correlaciones similares para PPR procariotas (Fig. 4A, B). Los microeucariotas son probablemente fitoplancton, que requieren nutrientes para la fotosíntesis, a diferencia de los procariotas que requieren materia orgánica como fuente de nutrición.

Para las microalgas eucariotas (fitoplancton) que poseen los “motores duales”, la energía suplementaria proporcionada por los PPR probablemente pueda respaldar su asimilación de dióxido de carbono [38] y conferir a estos organismos ventajas competitivas en un entorno de estrés nutricional. Se postula que los PPR en las diatomeas les permiten sobrevivir a la deficiencia de hierro [18]. Sin embargo, esta función puede no ser tan importante en nuestros sitios de estudio porque se ha informado que el agua superficial del NSCS no tiene limitación de hierro [53].

En los microorganismos portadores de PPR, los PPR pueden mejorar la aptitud en un entorno con bajo contenido de carbono orgánico disuelto (DOC) [54]. En el presente estudio, los taxones Flavobacteriaceae y Candidatus Pelagibacter ubique fueron los principales microbios que contenían rodopsina, GPR y BPR, respectivamente. Las flavobacterias desempeñan un papel vital en la mineralización del DOC en el océano. Por un lado, nuestros resultados mostraron que la expresión de PPR en Flavobacteriaceae estaba fuertemente correlacionada con la abundancia relativa de Flavobacteriaceae (Fig. 6B, R2 = 0,801), lo que indica el potencial de que PPR apoyara el crecimiento de estas bacterias. Por otra parte, Cand. P. ubique es una especie del clado SAR11, el grupo más abundante de bacterias heterótrofas en el océano [55, 56], que depende de la PPR para sustentar su respiración endógena de carbono cuando se enfrenta a la falta de carbono [57]. Su expresión de PPR también estuvo fuertemente correlacionada con su abundancia relativa (Fig. 6A, R2 = 0,8338). En Cand. En P. ubique, la abundancia relativa de transcritos de PPR fue mayor en la región de la pendiente que en la región de la plataforma (Fig. 5) y, de acuerdo con la noción de que la PPR se selecciona en ambientes pobres en nutrientes, se ha informado que la concentración de DOC es menor en la pendiente que en la región de la plataforma. estante [58]. La PPR podría ayudar a mejorar la aptitud de Cand. P. ubique en un ambiente bajo en DOC.

Se ha demostrado que la distribución en profundidad de diferentes rodopsinas que absorben espectros está relacionada con las características de distribución de la luz [40]. En nuestros resultados, los GPR fueron muy abundantes tanto en el número de unigenes como en la cantidad de ARNm en organismos de gran tamaño en el agua superficial en ambas estaciones, especialmente en la estación de plataforma, mientras que los BPR fueron dominantes en microorganismos de pequeño tamaño en las aguas más profundas. , especialmente en la estación del talud continental (Fig. 5). Este patrón es generalmente consistente con el patrón de atenuación diferencial espectral de la luz en la columna de agua (la luz azul penetra más profundamente que la luz verde), lo que indica una evolución adaptativa de los microbios.

Esta adaptación evolutiva puede explicar la distribución diferencial de dos grupos importantes de bacterias. En nuestras muestras, las Flavobacteriaceae eran más abundantes en la superficie y sus PPR eran del tipo absorbente de luz verde. Por el contrario, el cambio en la abundancia relativa de Cand. P. ubique a diferentes profundidades de agua era más pequeña que Flavobacteriaceae (recuadros de la Fig. 6), reflejando el patrón de sus PPR (Fig. 5), que era más estable entre la superficie y el DCM en Cand. P. ubique que en Flavobacteriaceae. Esto coincide con el hecho de que la PPR de Cand. P. ubique era del tipo absorbente de luz azul, y la luz azul puede llegar más profundamente en la columna de agua.

El análisis de cambio de espectro se basó en los resultados de las anotaciones en la base de datos SwissProt. Sin embargo, este método no es perfecto. Por ejemplo, los PPR en K. micrum y C. fusus se anotaron como GPR en los resultados de anotación de SwissProt. Sin embargo, estos PPR de K. micrum y C. fusus son en realidad BPR en lugar de GPR [59]. Corregimos su anotación a BPR y los resultados finales indican que había abundantes BPR en la fracción de gran tamaño y los dinoflagelados fueron los principales contribuyentes a los BPR de los protistas eucariotas en el área de estudio (Fig. 5). Además, los dinoflagelados poseen BPR y GPR además de Chl a, que posiblemente poseen la capacidad de utilizar longitudes de onda ligeramente diferentes a las del fitoplancton no portador de rodopsina en el NSCS.

Todos los conjuntos de datos utilizados en este artículo se han depositado en la base de datos NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) con el número de BioProyecto PRJNA729123, PRJNA782430 y CNGB Sequence Archive (CNSA) de la base de datos del Banco Nacional de Genes de China (CNGBdb). (https://db.cngb.org/cnsa/) con el número de acceso CNP0001483.

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Deseamos agradecer a Bangqin Huang, Xin Liu, Yanping Zhong, Chentao Guo y Yujie Wang de la Universidad de Xiamen por su ayuda con el muestreo y el apoyo logístico. También estamos en deuda con la tripulación y los participantes del crucero de investigación Yanping II por su ayuda en el muestreo.

Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional Clave de I+D de China (No.2022YFC3105301).

Laboratorio Estatal Clave de Ciencias Ambientales Marinas, Facultad de Ciencias Oceánicas y Terrestres, Universidad de Xiamen, Xiamen, 361102, China

Minglei Ma, Hongfei Li, Cong Wang, Tangcheng Li, Jierui Wang, Huatao Yuan, Liying Yu, Jingtian Wang, Ling Li y Senjie Lin

Centro Nacional de Investigación de Ingeniería para Acuicultura Marina, Universidad Oceánica de Zhejiang, Zhoushan, 316022, China

Hong Fei Li

Departamento de Biología e Instituto de Ciencias Marinas, Facultad de Ciencias, Universidad de Shantou, Shantou, 515063, China

Tangcheng Li

Laboratorio Central, Segundo Hospital Afiliado de la Universidad Médica de Fujian, Quanzhou, 362000, China

Liying Yu

Laboratorio de Biología Marina y Biotecnología, Laboratorio Nacional de Ciencia y Tecnología Marinas de Qingdao, Qingdao, 266237, China

Senjie Lin

Departamento de Ciencias Marinas, Universidad de Connecticut, Groton, CT, 06340, EE. UU.

Senjie Lin

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MLM analizó los datos, preparó las cifras y redactó el artículo; CW y TCL proporcionaron muestras; HFL y JRW realizaron los experimentos; HTY, LYY, JTW & LL brindaron asesoramiento sobre el análisis de datos; SJL concibió y supervisó el diseño del proyecto y revisó el manuscrito.

Correspondencia a Senjie Lin.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Ma, M., Li, H., Wang, C. et al. Un estudio comparativo revela la importancia relativa de las rodopsinas de la bomba de protones procariotas y eucariotas en un mar marginal subtropical. COMUN ISME. 3, 79 (2023). https://doi.org/10.1038/s43705-023-00292-y

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Recibido: 21 de marzo de 2023

Revisado: 02 de agosto de 2023

Aceptado: 04 de agosto de 2023

Publicado: 18 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s43705-023-00292-y

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